Calcein AM /PI活细胞/死细胞双染试剂盒

Calcein AM /PI Double Stain Kit  

产品信息

产品描述

钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可同时使用，对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管 Calcein-AM 本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM 能脱去AM 基，产生的 Calcein 能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)，因此 Calcein-AM 仅对活细胞染色。另一方面，作为核酸染料的PI 不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发 射: 617 nm)。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用 545 nm 激发，仅可观察到死 细胞。钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可同时使用，对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。

产品组成

保存方式

-20℃避光干燥保存。

使用方法

用荧光显微镜观察细胞形态

以 HeLa 细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度，有不同的观察条件。

1. 染色工作液的配制添加 2.5 µL Calcein-AM 储备液（4 mM）和 12.5 µL PI（2 mM）储备液至 5 mL PBS 中配制成染色溶液。Calcein-AM 的终浓度为 2 µM，PI的终浓度为 5 µM。 

【注意】由于 Calcein-AM 的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。 

2. 细胞染色 

1) 染色 HeLa 细胞等贴壁细胞时，先用 Trypsin-EDTA 等消化细胞，制备成细胞悬液。 

2) 将细胞悬液离心 3 分钟 (1000 rpm)。 

3) 去除上清液，加入 PBS 缓冲液，细胞数量调整至 1×10 5-1×10 6个/mL。再用移液器充分混匀。 

4) 由于培养基中的血清等成分含有酯酶，Calcein-AM 会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用 PBS 洗涤数次直到完全洗净。 

5) 将 200 µL 细胞悬液移至小试管中，加入 100 µL 染色溶液，在 37℃下孵育 15 分钟。 

6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。 

7) 在荧光显微镜下，先用 490±10 nm 波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用 545 nm 波长激发，能够看 到红色的死细胞

3. 染色试剂的最佳浓度 

Calcein-AM 和 PI 最佳浓度根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。 

1) 通过在 0.1%皂苷或 0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育 10 分钟或通过在 70 %乙醇中孵育 30 分钟制备死细胞。 

2) 用 0.1-10 µM PI 溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的 PI 浓度。 

3) 用 0.1-10 µM Calcein-AM 溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的 Calcein-AM 浓度。接着用该浓度的 Calcein-AM 对活细胞染色 以检验活细胞可否被染色

注意事项：

1. Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20度下密闭冷冻保存，防止水分进入。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。

2. 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，使用时一定要带手套、眼罩、口罩。万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗

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