ROS活性氧检测试剂盒
Reactive Oxygen Species Assay Kit
产品信息
| 产品货号 | 产品名称 | 规格 | 价格（元） |
| DY10507 | ROS活性氧检测试剂盒 | 1000T | 755 |
产品描述
活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧定量检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种经典的组织或活细胞中活性氧检测方法。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup 为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。
本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。
产品组成
组分名称 | 规格 | |
A液 | DCFH-DA(10 mM) | 0.1 mL |
B液 | 活性氧阳性对照（Rosup, 500 mM） | 1 mL |
保存方式
4℃避光干燥保存，有效期1年。
使用方法
1. 装载ROS 探针
1.1 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
a) 细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞数量小于5×105个/mL。
b) 药物诱导：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的药物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
c) （可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup, 500 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 mins，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90 mins。
d) ROS 探针准备：探针装载前按照1:1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
e) ROS 探针装载：吸除处理药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA 工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，对于96 孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 mins。
f) 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1～2 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
1.2 收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)
a) 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
b) 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
c) （可选）阳性对照：先用无血清培养基稀释阳性对照（Rosup, 500 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 mins，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90mins。
d) ROS 探针准备：探针装载前，按照1:1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
e) 探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，使其细胞密度为1×106～ 2×107个。然后又加入稀释好的探针，37℃细胞培养箱内避光孵育30 mins。
【注意】细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104个，也不可多于106个。
f) 细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2. 荧光显微照相操作方法
a) 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
b) 荧光显微镜下，选用FITC 滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化。
3. 流式细胞分析操作方法
a) 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5～1×105个/mL)。
b) 选择流式细胞仪FL1 或BL1 通道，488 nm 激发，测定530 nm 的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。
注意事项：
1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2. 阳性对照Rosup 一般使用浓度为100 μM （推荐浓度100-400 μM，具体依细胞类型而定）。通常刺激后0.5-4 h 可观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 mins 内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
3. 对于某些特别的细胞，实验过程中如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000 稀释DCFH-DA ，使DCFH-DA 的终浓度为2-5 μM。探针装载的时间也可以根据情况在15-60 mins内适当进行调整。
4. 活性氧阳性对照 (Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
5. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
6. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
7. 有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍，这样细胞紧密连接，贴壁比较牢，实验组的荧光值就高了。另外DCFH-DA很敏感，工作液浓度要低一些，1-2 μM即可，浓度太高容易有非特异性染色。此探针很不稳定，一旦氧化了本底荧光值就会升高，工作液最好现用现配。